Workshop: Análisis de datos de RNA-Seq

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####Dra. Evelia Coss, Sofia Salazar y Diego Ramirez 
#### 01/03/2024
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.left[.footnote[R-Ladies Theme[R-Ladies Theme](https://www.apreshill.com/project/rladies-xaringan/)]]

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### 1. Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) - Análisis funcional

### 2. Ejemplos de graficas

### 3. Ultima Practica

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## Pipeline bioinformática para RNA-seq

.pull-right[
<img src="data:image/png;base64,#figures/pipeline1.png" width="80%" style="display: block; margin: auto;" />
]

.left[.footnote[.black[
Imagen proveniente de [mRNA-Seq data analysis workflow](https://biocorecrg.github.io/RNAseq_course_2019/workflow.html)
]]]

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# Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) - Análisis funcional

**Análisis de funcional de genes expresados o  diferencialmente expresados**

- [Ejemplo con m&ms](https://www.youtube.com/watch?v=udyAvvaMjfM)

]

]

.left[.footnote[.black[
Para más información visita [Bioinformatics Breakdown](https://bioinformaticsbreakdown.com/how-to-gsea/).
]]]

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.left[.footnote[.black[
Imagen tomada de [Galaxy Europe](https://usegalaxy-eu.github.io/posts/2019/11/20/gProfiler/).
]]]

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.left[
<img src="data:image/png;base64,#figures/gprofiler_logo.png" width="30%" style="display: block; margin: auto;" />
]

## GSE function workflow para el paquete `gProfiler2`

### Inputs:

- `gene_list` = lista de genes en formato **vector** con los geneID en formato NCBI (EntrezID), Ensembl ID o Symbl.
- `Universo` = Todos los genes reportados en la base de datos, el paquete ya lo tiene pre-cargado.
- `pval` = P-value threshold proveniente del analisis

### Informacion:

- [Manual de gprofiler2](https://cran.r-project.org/web/packages/gprofiler2/vignettes/gprofiler2.html)
- [Pagina web](https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/page/r)
- [Paper](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7859841/)

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.left[
<img src="data:image/png;base64,#figures/gprofiler_logo.png" width="30%" style="display: block; margin: auto;" />
]

### Explicación sobre el análisis

### Existen otros paquetes

- fgsea, clusterProfiler, EnrichR, GORilla, topGO, AnnotationHub, goseq

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.left[.footnote[.black[
Imagen tomada de [clusterProfiler](https://github.com/YuLab-SMU/clusterProfiler).
]]]

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## Tipos de GOterm

- **BP :  Biological process**
  - Oligopeptide transport, response to abiotic stimulus, cell cycle

- **MF :  Molecular function**
  - Identical protein binding, endopeptidase activity

- **CC : Celular component**
  - Apoplast, cell wall, extracellular region, cell surface

## KEGG pathway

- Rutas metabólicas / enzimáticas.

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## Ejemplo - GSEA

.left[.footnote[.black[
Imagen tomada de [Ghosh, *et al*, 2010. *BMC Medical Genomics*](https://bmcmedgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/1755-8794-3-56).
]]]

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## Dotplot
### Tus primeros pasos

.left[.footnote[.black[
Imagen tomada de [NGS Analysis](https://learn.gencore.bio.nyu.edu/rna-seq-analysis/gene-set-enrichment-analysis/).
]]]

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## Ejemplo - GOterms

.left[.footnote[.black[
Imagen tomada de [Chen, *et al*, 2019 *Mol Med Rep*](https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30569111/).
]]]

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## Ejemplo - KEGG

.left[.footnote[.black[
Imagen tomada de [Chen, *et al*, 2019 *Mol Med Rep*](https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30569111/).
]]]

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## Ejemplo - KEGG 
### Visualizacion de ruta en R

.left[.footnote[.black[
Imagen tomada de [NGS Analysis](https://learn.gencore.bio.nyu.edu/rna-seq-analysis/gene-set-enrichment-analysis/).
]]]

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## Redes de regulacion

Pueden realizarlo en [STRING](https://string-db.org/)

.left[.footnote[.black[
Imagen tomada de [Chen, *et al*, 2019 *Mol Med Rep*](https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30569111/).
]]]

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## Pasos a seguir para el análisis de los datos de **RNA-Seq**

- Script [`load_data_inR.R`](https://github.com/EveliaCoss/RNAseq_classFEB2024/blob/main/Practica_Dia2/scripts/load_data_inR.R):

**1)** Importar datos en R (archivo de cuentas) + metadatos y **2)** Crear una matriz de cuentas con todos los transcriptomas

- Script [`DEG_analysis.R`](https://github.com/EveliaCoss/RNAseq_classFEB2024/blob/main/Practica_Dia3/scripts/DEG_analysis.R):

**3)** Crear el archivo `dds` con `DESeq2`, **4)** Correr el análisis de Expresión Diferencial de los Genes (DEG), **5)** Normalización de los datos, **6)** Detección de batch effect y **7)** Obtener los resultados de los contraste de DEG

- Script [`VisualizacionDatos.R`](https://github.com/EveliaCoss/RNAseq_classFEB2024/blob/main/Practica_Dia3/scripts/VisualizacionDatos.R):

**8)** Visualización de los datos

- Script [`GOterms_analysis.R`](https://github.com/EveliaCoss/RNAseq_classFEB2024/blob/main/Practica_Dia4/scripts/GOterms_analysis.R):

**9) Análisis de Terminos funcionales (GO terms)**

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