RNAseq_classFEB2025

Análisis de datos de RNA-Seq 👾

Instructora: Dra. Evelia Coss, Posdoc de la Dra. Alejandra Medina, LIIGH-UNAM

Clases para los alumnos de Ciencias Genomicas de 4to semestre de la ENES, Juriquilla (25 y 27 Febrero, 4 y 6 Marzo 2025). Formando parte de la clase de Bioinformática y Estadística 2.

Descripción

El módulo consta de sesiones teóricas y prácticas impartidas de forma presencial, que cubrirán aspectos básicos del tópico como:

Calidad y limpieza de archivos fastq
Alineamiento y ensamblaje con el genoma de referencia usando STAR
Generación del archivo de cuentas crudas
Importar datos en R
Normalización y corrección por batch
Expresión diferencial con DESEq2 y edgeR
Análisis funcional de los genes detectados
Visualización grafica de los resultados

Se ofrecerán presentaciones detalladas sobre el uso de programas clave, todos de código abierto, utilizando datos extraídos de bases de datos. Además, se introducirá el uso de scripts sencillos en Bash y R, con el objetivo de aprender los conceptos básicos de estos lenguajes para el análisis de datos transcriptómicos.

Contenido 📌

Dia 1. Aspectos generales de RNA-Seq / Control de calidad de los datos
Dia 2. Diversos pipeline para Alineamiento, ensamblaje y conteo de reads
Dia 3. Importar datos en R, Normalización y Corrección por batch / DEG con DESeq2
Dia 4. GSEA - Análisis funcional

Dia 1. Aspectos generales de RNA-Seq / Control de calidad de los datos

Fecha: martes 25 de febrero 2025
Presentación:
Datos: /mnt/atgc-d1/bioinfoII/rnaseq/BioProject_2025/
Tarea para el jueves 27 de feb: Elegir en equipos los transcriptomas que emplearán en su proyecto - Información diapositiva 60 y Google Classroom ENES

Ejemplo de entregable: Reporte

Bioproject que usaron anteriormente (NO SE PUEDEN USAR): PRJNA821620 (At), PRJNA256121 (At), PRJNA858106 (Hs), PRJNA826506 (Hs), PRJNA649971 (Mm), PRJNA743296 (Hs), PRJNA739157 (Hs), PRJNA983389 (Hs), PRJNA759864 (Hs).

Bioproject dados en cursos (NO SE PUEDEN USAR): PRJNA649971 (Mm) - RNASeq_Workshop_Nov2023 y RNAseq_classFEB2024, PRJNA821620 (At) - RNAseq_classFEB2023

Lecturas y cursos recomendados:

Dia 2. Diversos pipeline para Alineamiento, ensamblaje y conteo de reads

Fecha: jueves 27 de febrero 2025
Presentación:
- Diversos pipeline para Alineamiento, ensamblaje y conteo de reads
Lecturas y cursos recomendados:
- Alineamiento de novo - Trinity
- Alineamiento con el genoma de referencia - STAR
- Pseudoalineamiento con Kallisto
- Pseudoalineamiento con Kallisto - practica
Tarea para el martes 4 de marzo:
- Descripción de los datos (entregable 1, fecha límite: 25 de febrero).
- Explicación de las gráficas generadas por MultiQC.
- Conclusión sobre los datos:
  - ¿Son viables para continuar con el análisis?
  - ¿Qué pasos deben seguirse para mejorar la calidad de los datos?

Ejemplo de entregable: Reporte

Subir en la tarea de Google Classroom

Dia 3. Importar datos en R, Normalización y Corrección por batch effect 🪲 / DEG con DESeq2

Fecha: martes 4 de marzo 2025
Presentación:
- Importar datos en R, Normalización y Corrección por batch / DEG con DESeq2
Scripts: https://github.com/EveliaCoss/RNAseq_classFEB2025/tree/main/Practica_Dia3/scripts/
Lecturas y cursos recomendados:

Dia 4. GSEA - Análisis funcional

Fecha: jueves 6 de marzo 2025
Presentación:
- GSEA - Análisis funcional
Lecturas y cursos recomendados:
- Base de datos Gene Ontology Resource
- Base de datos AmiGo2
- Reducir terminos con REVIGO
- Heatmap con ComplexHeatmap - Github
- Heatmap con ComplexHeatmap - manual

Requisitos

Contar con una terminal en tu sistema operativo
Los paquetes que emplearemos en R v4.0.2, se encuentran presentes en el cluster DNA, por lo que, no es necesario instalar nada en nuestras computadoras.
Nodo de prueba (qlogin)

Pipeline ⚡

Pasos a seguir para el análisis de los datos de RNA-Seq

Script load_data_inR.R:

1) Importar datos en R (archivo de cuentas) + metadatos y 2) Crear una matriz de cuentas con todos los transcriptomas
Script DEG_analysis.R:

3) Crear el archivo dds con DESeq2, 4) Correr el análisis de Expresión Diferencial de los Genes (DEG), 5) Normalización de los datos, 6) Detección de batch effect y 7) Obtener los resultados de los contraste de DEG

Los siguientes script se pueden emplear para todas las especies, siendo sencillo su formato y empleo:

Script VisualizacionDatos.R:

8) Visualización de los datos
Script GOterms_analysis.R:

9) Análisis de Terminos funcionales (GO terms)

Clase para mejorar tus skills

Crear llaves y alias

Puedes crear llaves (ssh-keygen) y alias para acceder a los servidores de una manera segura y rápida: https://github.com/EveliaCoss/keygen