Apêndice B — Extra relacionado a perguntas biológicas
B.1 Bloco 9 - Extra (opcional, pós-aula) - desafios em cascata
Autoestudo opcional. Cada desafio abaixo descreve uma cadeia de dois ou três bugs encadeados, em que corrigir um faz surgir o próximo. O objetivo é praticar a subida pela cadeia: quando um resultado posterior está errado, qual verificação anterior teria detectado isso?
Trate cada desafio como um exercício de reflexão. Tente escrever o diagnóstico e a correção como comentários ANTES de executar qualquer código. A revelação ao final de cada desafio explica a cadeia.
B.1.1 Desafio 9.1 - O subconjunto de células T que desaparece
Sintoma (posterior): o SingleR retorna “CD4 T cell” para menos de 5 por cento das células em um conjunto de dados de PBMC em que a citometria de fluxo indica que as células T CD4 são 25 por cento. O painel de ADT mostra a proteína CD4 expressa normalmente.
Cadeia de diagnóstico (cada etapa faz surgir a próxima):
- Compare as células ADT-positivas para CD4 com as células RNA-positivas para CD4.
- Se as células ADT-positivas são abundantes mas as RNA-positivas são raras, a causa é dropout de RNA (território do Bloco 6). Pare aqui.
- Se as células RNA-positivas também são abundantes, verifique a referência do SingleR: ela tem um rótulo distinto de “CD4 T cell”, ou apenas “T cell”?
- Se a referência estiver correta, verifique o DefaultAssay e a camada sobre a qual o SingleR foi executado (data vs counts).
Experimente o diagnóstico neste objeto. Escreva sua previsão primeiro.
B.1.2 Desafio 9.1 - O subconjunto de células T que desaparece
Sintoma (posterior): o SingleR retorna “CD4 T cell” para menos de 5 por cento das células em um conjunto de dados de PBMC em que a citometria de fluxo indica que as células T CD4 são 25 por cento. O painel de ADT mostra a proteína CD4 expressa normalmente.
Cadeia de diagnóstico (cada etapa faz surgir a próxima):
- Compare as células ADT-positivas para CD4 com as células RNA-positivas para CD4.
- Se as células ADT-positivas são abundantes mas as RNA-positivas são raras, a causa é dropout de RNA (território do Bloco 6). Pare aqui.
- Se as células RNA-positivas também são abundantes, verifique a referência do SingleR: ela tem um rótulo distinto de “CD4 T cell”, ou apenas “T cell”?
- Se a referência estiver correta, verifique o DefaultAssay e a camada sobre a qual o SingleR foi executado (data vs counts).
Experimente o diagnóstico neste objeto. Escreva sua previsão primeiro.
B.1.3 Desafio 9.2 - O cluster que desaparece após o reagrupamento
Sintoma: um cluster do Bloco 4 (apenas RNA) desaparece quando você muda para o clustering de WNN no Bloco 6. As células que antes estavam nesse cluster agora estão espalhadas por vários outros clusters.
Cadeia de diagnóstico:
- Observe o RNA.weight das células que antes estavam nesse cluster. O ADT está dominando?
- Se o ADT domina, o cluster era mantido unido por variância específica de RNA que o WNN reduz o peso. Essa variância era biológica (programa gênico) ou técnica (um pequeno efeito de lote em um gene)?
- Faça uma tabulação cruzada do cluster anterior contra marcadores canônicos de linhagem. Se ele se divide claramente ao longo de um marcador de linhagem, o WNN encontrou uma estrutura mais fina. Se não, o ADT estava sobreponderado.
B.1.4 Desafio 9.3 - O doador saudável que se comporta como COVID-19
Sintoma: um doador Saudável na Etapa 6.12 mostra um perfil de tipo celular por doador muito mais próximo dos doadores com COVID-19 do que dos outros doadores Saudáveis.
Cadeia de diagnóstico:
- QC: a distribuição de nCount ou percent.mt desse doador é diferente?
- Anotação: um tipo celular específico foi super-atribuído nesse doador (deriva de anotação, não biologia)?
- Lote: esse doador foi processado em uma corrida de coloração diferente? Verifique adt_batch se o Cenário 4 do Bloco 8 foi executado.
- Troca de amostra: os campos de metadados do doador são consistentes (donor_id, condition, severity todos alinhados)? Uma troca de amostra durante a rotulagem produz exatamente esse sintoma.